哺乳动物体细胞核移植技术研究进展

1 体细胞核移植(克隆)的概念及其研究意义 体细胞核移植(克隆)是指成体动物细胞核经显微手术和细胞融合的方法移植到去核的卵母细胞内或将体细胞核直接注入到去核卵母细胞质中，重新组成胚胎并使之发育乃至产生子代。 克隆技术的研究不仅对胚胎学、细胞生物学、发育生物学等学科具有重大理论意义，而且已展示出广阔的应用前景。在科研上，可以用克隆技术研究机体渐成变化，研究某种细胞的全能性、体细胞衰老和发育的某些特征、动物发育过程中基因表达的调控等。对实验动物，遗传的均质性是最为重要的因素，用体细胞克隆技术可获得遗传物质均一的同一个体的多个后代，从而可提供特殊需要的实验动物。在畜牧业生产上，可以通过建立优良家畜的细胞系进行克隆动物生产，加快育种进程。在医学上体细胞核移植技术可用患者本人的细胞培育出新组织，用于治疗糖尿病、帕金森症和神经损伤等多种疾病。目前已有两家美国公司开始研究利用体细胞核移植技术生产人胚胎，希望大批生产治疗疾病的干细胞。此外利用体细胞核移植技术还可复制濒危的动物，保存和传播动物物种资源。

2 细胞核移植的研究历史 早在1938年德国胚胎学家Spemann曾将蝾螈受精后分裂前的卵用头发从动物极到菲律宾申博真人娱乐极缚成两部分，但不完全分开，中间仍有胞质相通。结果发现有核的一半能分裂，另一半则不分裂，等分裂到4或16细胞期，将缚的头发放松，让一个核进入原来没有核的部分，然后将发圈缚紧使两半完全分开，结果两半都能发育成正常胚，说明了这些细胞核在16细胞期每一个核的发育能力都是相等的，也是全能的。据此他在其名著《胚胎发育和诱导作用》中提出一种设想：如果能用细胞核移植的方法，将不同发育阶段细胞的核移到无核的卵中，将对研究核质关系具有重要意义。 1952年英国学者Briggs和King首先在豹蛙实现了Spermann的预言，他们将豹蛙囊胚顶部细胞的核移到去核的卵中，约有一半的重构卵能分裂并发育为部分或完整的囊胚。以后各国学者都相继在不同种两栖类中展开了同种的胚胎细胞核或成体细胞核移植方面的研究，都可获得正常子代。 1963年，童第周等首次报道了鱼类细胞核移植，在国际上首创移核鱼和培育鱼类新品种的一个新方法。 1981年Illmensee和Hoppe通过直接注射法把小鼠内细胞团细胞引入合子中后去核，生出了小鼠，这是首次哺乳动物细胞核移植成功的报道，但这项研究未能被重复出来，因而未能得到普遍承认。1983年，Mc-Grath和Solter采用新方法取得了合子核互换成功。随后，各国学者们开始对多种哺乳动物进行胚胎细胞核移植研究，并取得了丰硕成果。 1996年，英国学者Campbell用分离的9日龄绵羊胚盘细胞在体外培养建立细胞系，然后用此细胞系细胞作供体，以绵羊弃核卵母细胞为受体构建核移植胚，经移植后获得成活后代，这是世界首例以传代细胞为供体获得成活后代，也是从胚胎细胞核移植向体细胞核移植的一个关键性过渡。一年后，他的同事Wilmut将来自6岁绵羊的乳腺上皮细胞移人去核的卵母细胞后，得到世界上第一头体细胞核移植后代--"Dolly"，这是生物学史上一个里程碑式的事件，掀起了哺乳动物体细胞核移植研究高潮。

3 哺乳动物体细胞核移植技术研究现状 克隆绵羊Dolly的问世，不仅给人们的观念带来了很大的改变，而且由于克隆技术所蕴藏的商业和社会价值，在全世界引起了轰动。世界许多实验室都把研究方向转到哺乳动物体细胞克隆上，并已在猪、牛、山羊、绵羊、小鼠、兔和猫等许多动物上获得成功。其中研究最多最深人的还是牛，目前已用胎儿成纤维细胞、卵丘细胞、子宫细胞、输卵管细胞、耳细胞、皮肤细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、乳腺细胞及从初乳中获得的乳腺上皮细胞等获得了克隆后代。除了应用新鲜体细胞及卵母细胞进行体细胞核移植研究外，人们还对冷藏与冷冻保存的体细胞、卵母细胞或弃核并激活后的胞质体冷冻保存、克隆胚的冷冻保存的研究，对解决体细胞不能长期保存与应用的问题、屠宰淡季受体卵母细胞的供应问题及克隆胚的运输、保存及与受体动物子宫环境同步化的问题起到促进作用。一些学者已报道冻存卵母细胞可支持核移植胚发育到期。还有学者报道玻璃化冷冻的卵母细胞用于核移植和新鲜卵母细胞一样好。甚至有学者报道经血清饥饿进入静止期的卵丘细胞在一70℃冻一融后立即进行核移植，重构胚卵裂率高达97％，显著高于非冷冻细胞(85％)。 异种动物核移植也取得了令人瞩目的进展。1999年，Tanja　Diminko等证明去核的牛卵母细胞能使来自绵羊、猪、鼠、猴等不同种属动物的细胞核在体外发育成胚胎。继1999年获得以牛卵母细胞为受体，以大熊猫体细胞为供体的重构异种囊胚之后，中科院动物所陈大元所领导的研究组又经两年的努力，成功地使此异种重构胚在猫、犬及黑熊等动物子宫内附植(内部消息)。此外，中国南方一学者也于今年7月成功克隆出以兔卵母细胞为受体的人一兔重构胚。 对于克隆胚移植到受体后发育到期比例较低的原因，目前还不清楚，但据认为与胚胎分泌的IFN-tau水平较低、胎盘发育异常及核重编程不彻底等因素有关，而这些因素又可能与卵母细胞或重构胚的人工激活及重构胚的体外培养有关。因此，为将潜在的影响克隆成功率的因素降到最低，IrinaA等人在克隆猪时采用了二次核移植方案，即：用超排获得的卵母细胞作为一级重构胚的核受体，在一级重构胚发育到原核期时再将其原核移入到弃原核的体内来源的原核期合子内，然后迅速移人受体母猪子宫内，从而减少了卵母细胞体外成熟、重构胚人工激活及重构胚体外培养对其发育潜力的不利影响。目前，用此方案所克隆出的5只仔猪已三个月，健康状况都良好，可能与此改进的方案有关。但目前除猪、小鼠外，在其它动物尚未有人采用此方案。 但IrinaA等人在构建一级重构胚过程中仍采用了MII期弃核法，而目前已有实验证明：TII期弃核效率却显著高于MII期。而且，由于TII期弃核吸除的胞质远少于MII期弃核(分别为胞质容积的1／l0和1／3)，使重构胚的囊胚发育率更高，质量更好。倘若在克隆猪的方案中采用TII期弃核法，其效率可能会更高。

4 目前存在问题 尽管克隆技术有着广泛的应用前景，但离产业化尚有很大距离。因为作为一个新兴的研究领域，克隆技术在理论和技术上都还很不成熟。在理论上，分化的体细胞克隆对遗传物质重编(细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程)的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄，克隆动物的连续后代是否会累积突变基因，以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。在实践上，要想将其大规模应用于生产上，还有许多问题有待解决：其一，克隆胚经移植后发育到期并产下活仔的比例太低，总体不到l0％，威尔穆特研究组在培育"多莉"的实验中，融合了277枚移植核的卵细胞，仅获得了"多莉"这一只成活羔羊，成功率只有0．36％，同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有1．7％和1．1％，即使是使用"檀香山"技术，以分化程度较低的卵丘细胞为核供体，其成功率也只有百分之几。而大规模商业上应用所要求的受体妊娠率至少要达到50％(每个受体牛平均移植3枚克隆胚胎)，这是最主要的问题；其二，新生仔畜的发育缺陷及死亡率或围产期死亡率较高。以克隆牛为例，日本、法国等国培育的许多克隆牛在降生后两个月内死去；到2000年2月，日本全国已共有121头体细胞克隆牛诞生，但存活的只有64头。观察结果表明，部分犊牛胎盘功能不完善，其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平；有些牛犊的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常发育；克隆动物胎儿普遍存在比一般动物发育快的倾向，这些都可能是死亡的原因。即使是正常发育的"多莉"，也被发现有早衰迹象。染色体的末端被称为端粒，它决定着细胞能够分裂的次数：每一次分裂端粒都会缩短，而当端粒耗尽后细胞就失去了分裂能力。1998年，科学家发现"多莉"的细胞端粒比正常的要短，即其细胞处于更衰老的状态。当时认为，这可能是用成年绵羊的细胞克隆"多莉"造成的，使其细胞具有成年细胞的印记，但这一解释目前受到了挑战。美国马萨诸塞州的Lanza R. P.博士等用培养的衰老细胞克隆牛，得到6头小牛，出生5-10个月后发现这些克隆牛的端粒比普通同龄小牛要长，有的甚至比普通新生小牛的端粒还长。现在还不清楚这一现象的原因，也不清楚为何与"多莉"的情况有巨大差别。但这一实验说明，在一些情况下克隆过程能改变成熟细胞的分子钟，使其"恢复青春"，关于这种变化对克隆动物寿命的影响，还有待于进一步观察。

5 发展趋势 目前科学家已利用体细胞核移植技术成功克隆厂多种动物，今后人们将不再以能克隆出某种动物为目的，而向更深层次研究--弄清已经分化的细胞核． DNA重新程序化的机理，从而能在根本上大幅度提高哺乳动物体细胞核移植成功率，降低克隆动物发育异常率，使之能够真正广泛应用到生产和科学研究上。 从濒危动物保种方面考虑，异种动物体细胞核移植也是今后的重要发展方向。尽管到目前为止绝大多数学者对此研究的可行性仍持怀疑态度，但中国科学院动物所陈大元所领导的研究组目前所取得的进展无疑使人们看到了异种动物克隆成功的曙光，并将吸引更多学者从事这方面的研究。 到目前为止，生产转基因动物的方法仍主要是1985年Hammer等建立的原核显微注射法，外源基因整合进生殖细胞的机率低而难以遗传给下一代。1998年AngelikaE．Schnieke等首先用转染的胎儿成纤维细胞进行核移植产生表达人Ⅸ因子的转基因羊，大大提高了转基因的效率[463，2001年我国学者也利用体胞核移植法生产出绵羊转基因囊胚。与转基因技术相结合，进行转基因克隆动物的生产既是目前大家的共识与研究热点，也是今后体细胞核移植研究的一个发展方向。