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抗炎免疫药理实验方法学的某些进展

时间:2014-10-02 15:25:19  来源:  作者:李 俊; 徐叔云

抗炎免疫药理学是药理学一门新的分支学科,其主要研究的目的是探讨抗炎免疫药物的作用,作用机制及作用的规律性,寻找防治炎症免疫功能紊乱性疾病的有效药物,从而有助于揭示炎症免疫功能紊乱性疾病的病因和病理机制。随着免疫学、分子生物学、病理学等相关学科的迅速发展,抗炎免疫药理学领域的研究十分活跃,涉及面很广,研究内容越来越丰富,而多学科的相互渗透,使抗炎免疫药理实验方法学有了较大的进展,这无疑对抗炎免疫药理学的发展起了积极的推动作用。为此本文从整体动物模型和细胞分子水平两个方面,就近年来该领域的实验方法学中的某些主要进展作如下综述。

 1 关节炎动物模型

大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis)模型是一种T细胞介导的自身免疫性疾病模型,是研究抗炎免疫药物及治疗人类风湿性关节炎药物的理想的动物模型,巳普遍受到人们的重视。季红等实验提示,AA免疫反应高峰期脊髓背角及背根神经节SP含量增多,耗竭脊髓背角SP,细胞免疫功能更为亢进,AA病情加重,人为增加脊髓背角SP含量,AA大鼠免疫水平降低。推测AA大鼠免疫反应的同时也刺激了含SP的感觉神经末梢,使脊髓背角SP含量增多,通过未知通路向高级中枢神经传递信息,整合后产生某种反馈抑制,作用于免疫系统,使之不致于反应过强,而起到一定的自身保护作用。提示免疫调节肽SP,特别是脊髓背角SP参与AA鼠免疫系统的调节。为从神经免疫调节探讨AA以及多种自身免疫性疾病的发病机理,开发新型抗炎免疫药物提供了新思路。 重型胶原关节炎(collagentype重induced arthritis,CII A)是Trentham等1977年首次建立的实验性关节炎模型.1980年代至90年代初期,国外大量重复,并在临床表现、病理组织学和免疫学等方面进行了广泛、深入的研究,使其不断成熟和完善。鸡、小牛、大鼠的重型胶原均能引起关节炎。一般可在啮齿类动物和灵长类动物中产生.本所先后用小鼠、大鼠成功地建立了C II A模型。C II A与AA有许多相似之处,但在免疫指标上也有不同。CⅡA的免疫功能变化兼有体液免疫和细胞免疫,动物体内存在针对自身CII的高滴度IgG抗体,这些特性更接近人的类风湿性关节炎,因治此是筛选和研究治疗类风湿性关节炎药物的理想模型,也为今后研究人类与自身免疫有关的疾病提供了一个极有价值的实验模型。

2 系统性红斑狼疮动物模型

系统性红斑狼疮(SLE)是一种病因未明,累及多个系统,病程迁延反复的自身免疫性疾病。多年来,理想的动物模型的缺乏一直是影响SLE研究的主要原因。自六十年代起,国内外学者逐渐建立一系列SLE病理模型,包括自发性和实验性两类:

(1)自发性模型:主要包括三种品系小鼠:NZB/NZWFl(B/W)、MRL/MP-lpr(MRL-lpr)和BXSB。NZB/NZWFl小鼠是NZB与NZW小鼠的杂交子代,可自发性出现免疫异常,主要表现为,T、B细胞的过早发育与成熟,B细胞多克隆激活,抗核抗体出现及免疫复合物性肾炎.MRL-Lpr小鼠的基因组合75%来自LG,13%采自AKR,12%为C3H,0.3%为C57BL/6,H-2单倍型为H-2K。该鼠能自发性形成免疫复合物性肾炎,血清中有大量的抗核抗体,淋巴组织高度增生。而BXSB小鼠是(C57BL/6 JXSB/Le)F1,其H-2单倍型为H-2b,可出现T、B细胞异常增生,胸腺萎缩,亦可产生大量自身抗体及免疫复合性肾炎,后期可并发严重关节炎。这些小鼠的共同特征是自发性出现一些类似于人SLE的症状及免疫学异常,T细胞亚群在免疫功能紊乱中起重要作用。但这些模型发病较晚、周期长,不易控制实验过程。

(2)实验诱导SLE动物模型:主要包括同种异体淋巴细胞诱导的小鼠SLE模型,空肠弯曲菌诱导的小鼠SLE模型、pristerne诱导小鼠SLE模型以及肽类及人抗DNA独特抗体诱导的SLE模型。这些模型共同的特点是:自身抗体出现较早,一般在再次免疫1~4周内,1~2月内基本出现免疫复合物性肾炎等多器官慢性炎症表现,实验方法相对简单,而各模型各有特色。尽管上述模型与人类SLE还存在不少差距,但多种模型相互结合,为从不同侧面研究SLE的病理机制提供新途径。本所周玲玲分别采用空肠弯曲苗CJ-S131和Pristane成功地建立SLE小鼠模型,并初步探讨了免疫调节药白芍总甙和褪黑素对SLE小鼠的双向免疫调节作用。

3 免疫性肝损伤模型

目前对肝脏疾病的病理过程仍缺乏足够的认识。但肝内免疫反应巳被公认为造成肝损伤的重要机制之一。朱凡凡采用刀豆蛋白A(ConA)和2'-去氧鸟苷改变小鼠免疫状态,再用同系小鼠肝细胞膜特异性脂蛋白(LSP)免疫小鼠,诱导小鼠自身免疫性肝炎模型。我所陈学广等采用异品系小鼠LSP并在免疫LSP的同时辅以弗氏完全佐剂(FCA),使血清SGPT和LSP抗体滴度显著升高。近年来,先后建立了用异种血清,包括猪、牛、马血清,异体蛋白,包括猪白蛋白、血清球蛋白、人丙种球蛋白、人血白蛋白,BCG+LPS注射制作免疫肝纤维化病理模型。本所许建明采用短小棒状杆菌+LPS序贯静脉注射建立免疫性肝损伤,该模型发病快,血SGPT在造模后16-18 h达高峰水平,并伴肝脾明显肿大,血浆NO水平升高和脾细胞致分裂素反应明显下降的特点。为模拟临床肝炎的细胞免疫病理过程,徐强等采用1%Picryl chloriele(Pcl)乙醇溶液腹部涂药致敏,再用0.2%~0.5%Pcl的菲律宾申博真人娱乐油溶液肝穿刺攻击,18h后模型组血清转氨酶显著上升,肝组织坏死,炎性细胞浸润,甚至浸及整个肝脏。上述模型的建立,为肝损伤的机制及药效评价开辟了新的途径,但仍与病毒性肝炎免疫损伤所致的纤维化模型有相当大的差异。寻找新的、在免疫及病理学等方面相比更接近临床肝炎的动物模型仍是今后人们努力的方向。

4 艾滋病动物模型

艾滋病(AIDS)是20世纪人类的头号病魔。寻找合适的动物模型一直是AIDS研究的重大难题之一。理想的AIDS动物模型应是:能感染HIV; 动物体型小;遗传、免疫、代谢特性较清楚,靶细胞应该是CD4+淋巴细胞和巨噬细胞为主。靶器官应包括血清、淋巴组织和脑,传染方式应类似HIV,发病症状与人AIDS相似。但至今尚未发现理想的动物模型。近年来,有关艾滋病动物模型的研究取得了一些进展。常用的评价艾滋病治疗药物的鼠模型主要有;

(1)鼠白血病病毒模型 鼠白血病病毒(Murine leukernia virus,MULV)属于反转录病毒,接种于敏感鼠后可以导致脾淋巴结增大,免疫抑制和机会性感染等症状,称为鼠艾滋病 (MAIDs).该模型也被用于研究和评价AIDS的治疗药物以及免疫调节剂。

(2)嵌合鼠模型 利用严重联合免疫缺陷小鼠(SCID)缺乏功能性T、B细胞,而不发生异体移植排斥反应的特性,将胚胎组织或末梢血细胞移植给SCID,从而建立嵌合型鼠模型。其特点是对多种病人血液中HIV-1分离株和实验室HIV-1株敏感。 MAIDs模型具有易建立、重复性好、安全周期短,不需特殊实验,不造成生物灾害等特点,作为筛选抗反转录病毒药物和免疫调节剂的模型具有明显的优势,但MULV虽携带反转录病毒所具有gag、pol、env等共同基因,没有HIV-1所特有的nef等调节基因。所以MULV/MAIDs系统只能用于评价那些作用于反转录病毒共同基因的药物。而SCID/HIV-1模型系统尚处于建立时期,操作复杂、病毒在体内复制过程和病理生理变化尚不清楚,但它毕竟是HIV-1感染的小动物模型,具有MULV/MAIDs系统不可比拟的优势,是一种很有希望的小动物模型。

5 早老性痴呆

早老性痴呆(Alzheimer's disease,AD)是一种与年龄相关的、进行性神经退化而导致痴呆的疾病。流行病学研究发现,使用抗炎药物的人群AD发病率,症状及持续时间均明显低于、轻于对照人群。近年来许多资料表明,炎症免疫机制在AD的发生发展中起重要作用。尤其是通过中枢小胶质细胞的激活,释放IL-1及IL-6等炎症细胞因子,促进脑内淀粉样前体蛋白(amyloid precursor peptide,APP)变为淀粉样蛋白β(amyloid β-peptide)及老年斑(senile plaques,SPS)的形成,使神经纤维缠结,突触减少和神经元丧失。此外,细胞凋亡、氧化应激、tau过度磷酸化等均可能是AD的发病机制。由于对AD发病机理尚缺乏根本的了解,因此尚缺乏真正的AD模型。目前常采用的主要有:1)AICl3渭胃,建立大鼠老年性痴呆模型,主要病理变化为在痴呆大鼠背海马结构各部位可见较多的β-AP样免疫反应神经元和较强β-APP表达:2)毁损Wistar大鼠迈内特基底核(nucleus basalis of Meynert,nbM)建立AD动物模型,其表现为记忆力下降,乙酰胆碱酯酶(AchE)锐减,β-AP和tau蛋白样免疫神经元增加、变性、坏死细胞形成,并有人AD相似的老年斑,3)采用海马内微量注射β-AP多肽诱发AD模型,注射一周,学习记忆发生改变,出现大量胶质细胞反应,神经原轴突退化。此外,还有鹅育覃氨酸基底前脑注射致胆碱能损伤大鼠,双侧颈总脉永久性结扎致脑缺血大鼠和D-半乳糖皮下注射后自由基增多致脑老化小鼠等。自1995年以来,发达国家巳用基因技术培育出早老性痴呆动物模型,国内已有单位引进日本快速老化小鼠(Senencence accelerated mouse,SAM)模型,但上述模型并不具备AD的全部特征,具有一定局限性。因此,采用不同模型,多方面着手,仍是研究该类药物的主要途径。

6 移植免疫 同种异体器官移植能导致受体动物产生排异反应。这种反应能被免疫抑制剂抑制或延缓,在动物实验中,多种器官可以进行异体移植,如皮肤片、肾、心脏、小肠、肝等,可通过免疫抑制对捧异反应的抑制程度来评价免疫抑制性药物。一般通过用药组和对照组的排异时间平均值来评价免疫抑制的作用强度.随着我国器官移植外科学的发展,器官移植手术在我国较大医院巳相当普及。相对来说,移植免疫的动物模型研究相对滞后,研究开发免疫抑制药物对移植免疫动物模型的影响相对较少,因此开展药物对器官移植免疫动物模型机理的研究,对提高我国移植外科医生的临床用药水平,发展我国自巳的免疫抑制药物,尤其从中草药中开发新型的免疫抑制具有重要的理论和现实意义。

7 神经免疫功能紊乱 疾病的动物模型 近年来研究发现,神经系统部分疾病的发病机制和免疫功能紊乱有关。巳明确中枢神经脱髓鞘引起多发性硬化(multiple sclerosis,MS)及周围神经脱髓鞘病格林-巴利综合症(GBS)等疾病与免疫功能有关。其中MS是以碱性髓鞘蛋白(myelin basic protein,MBP)为自身抗原,GBP则以周围神经髓鞘中P。蛋白为重要的抗原。实验性变态反应性脑脊髓膜炎和实验性变态反应性神经炎模型是人们研究神经免疫性疾病的常用模型。

(1)实验性变态反应性脑脊髓膜炎(EAE)是研究MS的理想动物模型.其发病机理,临床体征及病理组织改变和MS相似,因此被广泛用于研究MS的发病机理和药物治疗作用的研究,而且近年来有重要的突破。多数学者认为,MS是一中枢神经系统的自身免疫性疾病,是体内CD4细胞对自身抗原一种免疫反应,主要的自身抗原包括MBP或MBP的多肽片段、含脂蛋白(proteinlipid protein,PLP)等在动物小鼠、大鼠及豚鼠均能诱发成功。采用牛MBP致敏SJL小鼠建立实验性变态反应性脑脊髓模型,分离EAE发病动物外周血对CD4特异的T淋巴细胞,用此种细胞静脉注入同种健康小鼠,可建立被动转移EAE模型。该模型可以更直接地用于研究EAE和MS的发病机理,及药物预防和治疗机理的研究。

(2)实验性变态反应性神经炎模型(EAN)采用牛MBPP2蛋白加弗氏不完全佐剂,多点基础免疫7d后,同剂量加强免疫一次,一周后动物发病。主要动物为Lewis大鼠或兔。其主要表现为:精神萎靡、体重下降,先出现双下肢无力,逐渐加重到瘫痪,随之发展到四肢瘫痪、四肢针刺反应减退。此种动物模型的发病机理、临床体征及组织病理与人类格林巴利综合征(GBS)相似,因此,EAN作为GBS的动物模型巳被国际所公认并广为应用。

8 粘膜耐受实验研究方法 粘膜耐受(MT)是指粘膜通过口服或鼻腔吸入等途径接触蛋白质抗原后,再用此种蛋白进行粘膜外免疫,引起的一种系统低反应状态。1911年Wells首次用公鸡卵白蛋白喂豚鼠,发现豚鼠对此种蛋白质引起的过敏具有抵抗性,Chase用二硝基氯苯喂豚鼠,发现豚鼠对二硝基氯苯的皮肤反应性降低。八十年代,口服耐受才应用到炎症免疫性疾病动物模型的治疗上.此外,研究发现,鼻腔给予蛋白也是一种有效诱导免疫耐受的研究的方法。 粘膜耐受的机制较为复杂。一般认为小剂量抗原口服后,通过调节性T细胞分泌一些抑制性细胞因子如TGF-β、IL-4、IL-10等,介导导主动抑制,大剂量口服或吸入后,抗原通过作用胸腺、脾脏及粘膜局部伴发的淋巴组织等处的Thl、Th2细胞,使其克隆无能(cloneanergy)或克隆清除(clonedeletion)发挥免疫耐受作用。目前,通过口服Ⅱ型胶原可以明显抑制由Ⅱ型胶原诱导的大鼠或小鼠的关节炎;口服MBP、可以对MBP诱导Lewis大鼠和SJL小鼠的EAE发挥明显治疗作用,通过口服耐受治疗其他免疫功能紊乱性疾病的研究正在国内外许多实验室进行,而且走在逐步应用临床。因此,MT的研究,对于炎症免疫性疾病的治疗提供了新的思路。

9 结语

炎症与免疫是机体的两种不同功能,但又密切相关不可分割,其相互之间的关系,错纵复杂。抗炎免疫药理学主要研究药物对炎症和免疫功能的作用及其机制,为炎症免疫性疾病的药物治疗提供理论基础。实践证明,多数抗炎免疫药物在发挥抗炎作用的同时,又影响机体的免疫功能,使机体异常的免疫状态(升高或降低)恢复,(而对正常的免疫功能无明显影响;抗炎免疫药物多作用于炎症免疫功能的不同环节,但离不开机体神经内分泌系统内环境的相互影响,且不同品种、性别年龄的动物对抗炎免疫药物的反应可能不同.因此,在进行抗炎免疫药理学研究时,应合理选择不同的实验方法,尤其注意要;

1)正常与病理动物模型相结合;

2)体内与体外实验互相补充;

3)多种方法、多项指标综合评价。

此外,还要注意选择敏感的实验动物。诚然,目前市场上出现相当多品种的抗炎免疫药物,但其临床应用效果远没有达到理想的水平。其主要原因是炎症免疫调节网络的复杂性,现行的抗炎免疫药理方法尚难以确切地评价其疗效。当今抗炎免疫药理学的研究在生物医学领域里,既是热点所在,亦面临着巨大的挑战,相信在未来的发展中将会有新的突破。

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